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支原体检测试剂盒

                      ——高效、灵敏、便捷、质优、价廉

支原体检测试剂盒使用说明书

 

 

  1. 试剂:支原体检测试剂盒由武汉源深生物提供。
  2. 实验方法:

 

巢式PCR的方法检测支原体污染:

  1. 待检细胞汇合率在90%以上时取100 µL细胞上清液到离心管内
  2. 95oC孵育5分钟
  3. 短暂高速离心15秒钟左右
  4. 试剂盒里的组份:

引物混合物     (Primer Mix)                     20 µL

阳性对照DNA  (Positive Control DNA)             15 µL

阴性对照       (Internal Control DNA)             20 µL

巢式PCR一共需要做2轮PCR,本检测方法不受其他来源(如所培养细胞)DNA的影响,不但提高了检测的灵敏度,同时也提高了特异性。

 

  1. 第一轮PCR:

PCR 混合物:

向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分,

 

 

PCR组分(单位:µL)

阴性

对照管

阳性

对照管

细胞

检测管

3

3

3

1st PCR引物混合物

4

4

4

阳性对照DNA

3

阴性对照DNA

3

处理后样品

3

2X Taq master mix

10

10

10

总体积

20

20

20

盖紧管盖,轻弹管壁混匀,稍加离心。

 

  1. 热循环程序:

将准备好的PCR管放入PCR仪,运行如下程序。

 

 

94oC 9 min

1个循环

94oC 30 sec

30个循环

60oC 2 min

72oC 2 min

72oC 5 mins

1个循环

降温至4oC

 

 

支原体检测试剂盒

                      ——高效、灵敏、便捷、质优、价廉

 

  1. 第二轮PCR:

PCR 混合物:

向0.2 mL PCR薄壁管中依次加入以下组分,

 

 

PCR组分(单位:µL)

阴性

对照管

阳性

对照管

细胞

检测管

3

3

3

2nd PCR引物混合物

4

4

4

阳性对照第一轮PCR 产物

3

阴性对照第一轮PCR 产物

3

处理后样品第一轮PCR 产物

3

2X Taq master mix

10

10

10

总体积

20

20

20

盖紧管盖,轻弹管壁混匀,稍加离心。

 

  1. 热循环程序:

将准备好的PCR管放入PCR仪,运行如下程序。

 

 

94oC 9 min

1个循环

94oC 30 sec

30个循环

60oC 2 min

72oC 2 min

72oC 5 mins

1个循环

降温至4oC

细胞培养常见问题

1.如何选择培养基?

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养,各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基(SFM)。

2.为什么要热灭活血清?

加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。

3.L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但是确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?

GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物,将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽,释放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常稳定,即使在121磅灭菌20分钟,GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解,如果在相同条件下,L-谷氨酰胺几乎完全降解。

5.为什么培养基中可以省去加酚红?

酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,培养细胞,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。

6.如何用台盼兰计数活细胞?

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升,在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀,数分钟后,用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰,因而染成蓝色的细胞是死细胞。

7.如何消除组织培养的污染?

当重要的培养污染时,研究者可能试图消除或控制污染。首先,确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母,把污染细胞与其它细胞系隔离开,用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台,检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性,因而,做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞,稀释到常规细胞传代的浓度。

2)分散细胞悬液到多孔培养板中,或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内,把选择抗生素加入到每一个孔中。例如,两性霉素B推荐下列浓度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

3)每天观测细胞毒性指标,如脱落,出现空泡,汇合度下降和变圆。

4)确定抗生素毒性水平后,使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。

5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

6)重复步骤4。

7)在无抗生素的培养基中培养4-6代,确定污染是否以已被消除。

8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么?

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。

9.Hank’s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用,不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle’s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?

HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡,以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中,溶液会变碱,Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织,需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织,用Hanks液就可以了。

10.Qualified和Certified 胎牛血清有什么差别?

Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序,而且除了这些标准检测,Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测:

End-Point Determination of Endotoxin Content

噬菌体检验

生物化学检测

激素的检测

血红蛋白检测

Sf9 细胞生长促进及方法学检测

11.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前,用EDTA清洗细胞,以消除来自培养基中所有的二价离子。

12.制备lipid-DNA的方法会影响转染效率吗?

是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent,稀释试剂在100μl OPTI-MEM中,稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent,在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后,在复合物中加入含有血清的培养基(800μl)。(注意以上是35mm培养皿使用体积)。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体,接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。

13.我使用SF900 Ⅱ时,细胞生长良好,但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好?

如果目的蛋白是一个后期蛋白,它将与蛋白酶一起表达,这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中,这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白,从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中,蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题,加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清(少于1%),让血清给蛋白酶提供作用底物。

14.如何检测内毒素(热源)水平?

LAL(Limulus Amebocyte Lysate)试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎(Limulus polyphemus)血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统(丝氨酸蛋白酶级联反应系统),通过修饰凝集素,产生一种透明的胶,LAL中的凝固蛋白,从而,形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎(血细胞)裂解物。

胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island,按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前,用无热源的水1:10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟,以消除抑制剂。(通常,血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程,使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。)

15.我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗?

如果使用固体形式的培养基,需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌,应该高压灭菌琼脂溶液,然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。

16. 20℃下配制的缓冲液,在较高或较低的温度下PH值会改变吗?

对于普通使用的缓冲液,PH值随温度变化而变化。

下表列出温度改变10℃时,PH值的变化情况

例如20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为7.4-(2x0.310)=6.78

17. 室温下(25℃)配制的Tris-HCl溶液,在37℃使用时PH值是多少?

缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃,25℃,37℃时,不同的PH值。

  • 4°C 25°C 37°C
  • 8.1 7.5 7.2
  • 8.2 7.6 7.3
  • 8.3 7.7 7.4
  • 8.4 7.8 7.5
  • 8.5 7.9 7.6
  • 8.6 8.0 7.7
  • 8.7 8.1 7.8
  • 8.8 8.2 7.9
  • 8.9 8.3 8.0
  • 9.0 8.4 8.1
  • 9.1 8.5 8.2
  • 9.2 8.6 8.3
  • 9.3 8.7 8.4
  • 9.4 8.8 8.5

18. 昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少?

生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系,在PH值6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时,培养基的最适渗透压是345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式,减少技术问题,保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。

19. High Five细胞有任何其它名称吗?

High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

20.在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少?

High Five无血清培养基中去污剂的浓度:0.025 g/L Tween-80,1.0 g/L Pluronic Poly-all。

21.High Five细胞用多大的密度冻存?

3.0x10E6 cells/ml

22.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀,加热后溶解。它是什么?对我的细胞有害吗?

可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍,而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解,对实验不会有不利的影响。

23.如何从T25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗?

我们强力推荐使用脱落细胞的方法,因为这项技术破坏性最小,生活力最高。通过使用巴氏德吸液管,让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下,才使用胰酶消化细胞。

胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞:

  • 1)去除培养基。
  • 2) 用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞,去除PBS.
  • 3) 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆盖细胞表面)。
  • 4) 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。
  • 5) 向细胞中加入2ml 细胞培养液,移入锥形管,用2ml培养液洗瓶壁,移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性。)
  • 6) 离心(1100rpm)沉淀细胞。去除培养基。
  • 7) 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。

24.在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时,肝素的使用量是多少?

为了防止悬浮培养细胞聚集的形成,使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。

25.如何评估ES细胞合格的胎牛血清?

使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。相关生长效率分析:

当ES细胞以非常低的密度传入包含10%胎牛血清的生长培养基中,检测开始和支持ES细胞克隆的能力。

细胞毒分析:

当以非常低的密度传入包含30%胎牛血清的生长培养基中,检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。

相关形态学和分化分析:

检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红,分化的细胞较大,丰满,颜色较浅。

所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的,培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。(ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。)

经过培养发现,大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。

26.在重新冻存sf9细胞前,它可以传多少代?随着传代的次数的增加,它的感染能力会降低吗?

通常情况当细胞经过30次传代后,应该返回冻存。无论什么时候记数时,都应该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍,细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降,它们的感染力将不在是有效的。

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