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科研类试剂盒检测样本的鉴别方法

发布日期:
2011年11月8日 文章出处:来自
目前ELISA试剂盒检测的样本中,除了细胞上清外,还有比较大的一部分是血清和血浆样本。

对于ELISA客户来说,在实验中可能用到不同的样本,如何辨别所购的试剂盒能否测手中的样本呢?

对于最常见的细胞上清,我们大家知道,培养细胞过程中,无特别情况一般是10%的牛血清加入培养基中,经过培养后,细胞的吸收消耗,最后细胞上清中蛋白含量会很少,而且对于一般牛血清生产的厂家来说,在生产过程中已经去除了大部分对检测有干扰的物质,所以对一般ELISA而言,不会影响抗体抗原的结合。

那么比较常见的血清血浆样本呢?

血清是最常用的ELISA标本,ELISA检测中血浆一般可视为与血清同等的标本,标本中干扰性物质是引起检测后结果偏高或偏低的主要原因,干扰性物质分为内源性物质和外源性物质两大类:

1.内源性物质

常见的干扰物质有:类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。

(1)类风湿因子 :血清中IgM、IgG型类风湿因子(RF)在ELISA检测中,可与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合,从而导致检测OD值偏高。

(2)补体 : ELISA系统中固相一抗和标记二抗过程中,抗体分子发生变构,其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来,使C1q 可以将二者连接起来,从而造成检测OD值偏高。

(3)嗜异性抗体

人类血清中含有能与啮齿类动物(如鼠等)Ig (s) 结合的天然嗜异性抗体,可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来,也能造成检测OD值偏高。

此外血清中嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质及血清中脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等,均对ELISA测定结果有干扰作用。

2.外源性物质

外源性物质常常是由于用于ELISA测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集 不全和采血管中添加物等影响。

(1)标本溶血

由于各种人为原因引起的标本溶血,均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白,在以辣根过氧化物酶为标记的 ELISA测定中,会导致非特异性显色,干扰测定结果。

(2)标本受细菌污染 :因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶,因此,被细菌污染的标本同溶血标本一样,亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。

(3)标本保存不当 :在冰箱中保存过久的标本,血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体,在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成检测OD值偏高;

(4)标本凝集不全

综上所述,在ELISA检测中影响血清血浆样本的因素很多,在考虑试剂因素和操作因素之外,也应从标本因素方面进行分析。

血清和血浆样本

目前国内科研类试剂盒生产厂家声称各种标本都能检测,但使用后我们发现有些试剂盒对血清和血浆样本的检测效果不好,表现在光值偏低,如RF因子存在的话,光值偏高。产生上述现象的主要原因是杂蛋白较多,成份复杂。所以需要特别的试剂才能消除影响。

顾客如何分辨所购试剂盒是否能测血清血浆样本呢?

这要分几种情况:

1、如厂家没有提供专门用于血清血浆样本的缓冲液,那么只要用已知浓度的待测指标蛋白加入所测种属的血清直接加样和用已知浓度的待测指标蛋白加入PBS缓冲液中同时检测对比,即可知道该试剂盒是否可以直接用来测血清血浆样本。

2、如厂家没有提供专门用于血清血浆样本的缓冲液,只是有一个笼统的或统一的稀释液,那么只要用已知浓度的待测指标蛋白加入所测种属的血清直接加样和用已知浓度的待测指标蛋白加入厂家提供的统一的缓冲液中同时检测,也可得出该试剂盒是否可直接用来检测血清血浆样本。

3、如厂家提供专门用于血清血浆样本的缓冲液,可用已知浓度的待测指标蛋白加入所测种属的血清直接加样和用缓冲液按说明书分别加样,也可得出结果。

如该种类型试剂盒样本总量如为100μl的话,一般而言,会是50μl的样本加样量和50μl的特定的缓冲液。

在使用试剂盒的过程,可将已知浓度的蛋白用血清或血浆调配到试剂盒标定的检测限的最高值的2倍,加入50μl做两孔,一孔补入常规的50μl标准品稀释液,一孔补入50μl样本分析缓冲液,即可区分出效果来,有时候,有些厂家为了达到“消除”的效果,在样本分析缓冲液中加入待测目标蛋白,为了鉴别出这种情况,也可直接加入样本分析缓冲液做一孔,同时做对比,这样可试出试剂盒中的针对血清血浆样本的缓冲液是否真的有效。
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